（全文约6600字）
1.1. 富集分析概念
富集分析，本质上是对数据的分布检验，如果分布集中在某个区域，则认为富集。
常用的分布检验方法有卡方检验、Fisher精确检验以及KS检验等方法。
在 背景基因集(N) 下获得 一组特定基因集(S) ，S可能是基因列表，表达图谱，基因芯片等形式。在预先构建好 基因注释数据库(例如GO,KEGG等)已对背景基因集(N)根据生物功能或过程进行分类的前提下，通过 统计学算法找出有那些显著区别于背景基因集(N)的类别(生物组成/功能/过程)，或者找出这组特定基因集间在生物组成/功能/过程的共性，经过聚类后去除冗余得到基因富集结果的过程，即为富集分析。
- 其中， 背景基因集(N) 常常是一个物种的基因组注释基因总和。
- 一组 特定基因集(S) 常常是差异表达基因集(differentially expressed genes, DEGs)。
- 预先构建好 基因注释数据库常用GO或KEGG数据库。
- 常见的 统计学算法包括ORA,FCS,PT,NT四种。
通常会使用其他分析的结果作为 特定基因集(S)，做基因富集分析来查看这些基因集是否主要集中在某些类别，这些类别代表的功能是否与表型或者进化事件有关联。比如：
- 比较转录组分析得到的差异表达基因集；
- 比较基因组分析中得到的某物种特有的基因集；
- 基因家族收缩扩张分析得到的基因组中显著扩张/收缩的基因集；
- 基因组共线性分析中在全基因组复制事件附近的Ks值的基因集等各种分析得到的基因集；
1.2. 富集分析的算法
富集分析算法经过发展，常见的有四类：
过表达分析(ORA)是对背景基因集(N)和特定基因集(S)按照已知的基因功能或通路等分组，并鉴定特定基因集(S)在哪些组包含比背景基因集(N)比例更多的基因(过度表达，over-represented，即富集enriched)或更少的基因(表达不足，under-represented)的一种统计学方法。
ORA是出现最早，最常用，有完善的统计学理论基础的方法。ORA重点在于通过基因集组成的比例来判断富集程度。
ORA类方法用的是离散分布的检验（Fisher精确检验，依据超几何分布的原理）。
超几何分布有很多资料可参考，比如：https://www.jianshu.com/p/13f46bebebd4
- ORA使用的统计方法(例如超几何分布，二项分布，卡方分布)只考虑差异基因数量，忽略了差异程度(不同表达水平)，，需要人为设置阈值，没有一个设置规定，阈值设置有主观性。
- 通过一刀切的人为规定的阈值，找出差异最显著的单个基因，而忽略其他基因，比如差异小但变化方向一致的基因集，往往后者比前者更重要。
- 利用的统计学假设每个基因相互独立，但是就生物体本身而言，忽略了基因间内部的复杂的相互作用，并且每个基因在不同的生物学过程中发挥的作用大小不一样，同等看待结果可能会不准确。
-
假设每条通路都独立其他通路。
-
背景基因集(N)：常常是一个物种的基因组注释基因总和
- 特定基因集(S)：常常是差异表达基因集(differentially expressed genes, DEGs)
- 背景基因集的分类信息：常常通过注释数据库(GO,KEGG等)和背景基因集获得
- 特定基因集的分类信息：常常通过注释数据库(GO,KEGG等)和特定基因集获得
通过四组数据获得基因数量的2×2列联表，再利用fisher精确检验或超几何分布得到p值。认为设置一个显著性阈值，高于阈值的即为富集基因。
功能分类打分(FCS)与ORA相比进行了基本假设的改变，除了考虑单个基因的显著变化外，还考虑微效基因的叠加效果。
代表是基因集富集分析(Gene Set Enrichment Analysis, GSEA)
- 计算单个基因表达水平的统计值，采用如衡量差异基因的ANOVA、Q-statistic、t检验、Z-score、信噪比，进行打分或排序，或者直接使用排序好的基因表达谱
- 同一通路上所有基因的表达水平统计值进行整合，汇集成单个通路水平的分数或统计值，采用基因水平统计的和、均值或中位数，Wilcoxon rank sum, Maxmean statistic, Kolmogorov-Smirnov statistic
-
对通路水平的显著性进行评估：利用重抽样(bootstrap)的统计学方法
-
不需要人为规定的阈值来一刀切显著性
- FCS考虑同一通路中基因表达的协调变化，即考虑微效基因的叠加效果。
-
通过考虑基因表达的协调变化，FCS 方法解释了通路中基因之间的依赖性
-
与 ORA 类似，FCS 独立分析每个通路。一个基因可以在多个通路中发挥作用，这意味着这些通路可以交叉和重叠。
- 许多 FCS 方法使用基因表达的变化来对给定通路中的基因进行排序，并丢弃进一步分析的变化。例如，假设通路中的两个基因 A 和 B 分别发生 2 倍和 20 倍的变化。只要它们与通路中的其他基因相比具有相同的各自等级，大多数 FCS 方法都会平等地对待它们。
基因富集分析(GSEA)是FCS算法中最常用的一种。
- 基因排序
首先，根据各基因与表型间相关性r或两组间t检验统计量得分值对背景基因集(N)进行降序排列，比如把所有基因在两个分组(或表型)中的差异度从大到小排序，形成排好序的基因列表。
- 基因富集
查看基因注释数据库(GO/KEGG)中每个小组基因集(例如GO一个通路一个小组)里的基因是否在排序的背景基因集里均匀分布，或者主要分布在排序背景基因集的顶部/底部。均匀分布说明不在这两个分组(或表型)中富集，集中分布在顶部/底部说明这个小组基因集在两个分组(表型)之一富集。
- 富集分析
计算每一小组基因集的富集分数(enrichment score,ES)值，然后对ES值进行显著性检验和多重假设检验，计算得出显著富集的基因集。
- 计算富集分数(enrichment score,ES)
对每一个小组基因集，遍历排好序的背景基因集(N)，当基因出现在特定基因集(S)就加分，反之减分，加减分值由基因与表型的相关性决定。
- 估计ES的统计显著性
基于样品的置换检验可以计算P值。
- 多重假设检验矫正
根据每一小组基因集的大小对每个基因的ES做标准化，得到标准化NES（normalized enrichment score ，NES）。为了检验每一小组基因集的NES是否显著，将排好序的背景基因集(N)随机打乱排列一定次数，每次都计算每个基因集的NES(ES)，得到每个基因集的NES在随机排序情况下的理论分布，从而计算其p值。若p
Original: https://blog.csdn.net/qq_40569830/article/details/125471215
Author: 生信技工
Title: 富集分析：（一）概述
原创文章受到原创版权保护。转载请注明出处：https://www.johngo689.com/692954/
转载文章受原作者版权保护。转载请注明原作者出处！